Оценка антивирусного терапевтического действия препарата “Арамакс виктори Антивирал” в условиях in vivo

Целью работы явилось изучение возможного антивирусного терапевтического действия

«Арамакс виктори Антивирал» в условиях in vivo на модели сирийских хомяков.

1. Методики

1.1 Оценка антивирусного терапевтического действия препарата «Арамакс виктори Антивирал» в условиях in vivo проводилась на модели сирийских хомяков (Imai с соавт, 2020). После интраназального заражения вирус реплицируется в верхних и нижних дыхательных путях и поражает легкие. Эта модель может использоваться для оценки протективных свойств препаратов (Imai с соавт, 2020).

1.2 В качестве вируса использовался коронавирус человека SARS Cov-2 (штамм дельта). Дозу вирус определяли методом биологического титрования на чувствительных клетках (VERO) и методикой количественной ПЦР (rtPCR). Доза вируса при интраназальном заражении составляла 1х106ТЦД50/мл. Интраназально каждому хомяку вводилось не менее 0,1 мл физиологического раствора с указанной дозой вируса..

1.3 Сирийских золотистых хомяков (4 особи) через 48 часов после заражения использовали для изучения терапевтической активности препарата. С этой целью препарат «Арамакс виктори Антивирал» примешивался в воде для питья в расчетной суточной дозе 1 мл/кг. Доза препарата подбиралась c учетом более ранних исследований, показавших эффективность подобных доз в терапии различных вирусных заболеваний.

Одна группа хомяков (4 особи) служила положительным контролем и заражалась вирусом в аналогичной дозе как и экспериментальная и использовалась до конца эксперимента для контроля патологии индуцированной вирусной инфекцией. Еще одна группа хомяков (4 особи) получала инъекции физиологического раствора и использовалась в качестве контроля.

1.4 Клинический анализ крови у сирийских хомяков проводился во всех исследуемых группах на мазках крови, окрашенных по Гимза. На каждый срок исследования готовились 2 мазка крови. На каждом мазке исследовалось не менее 100 полей зрения. Усредненные значения всех ядерных элементов суммировались и приводились в процентном соотношении.

1.5 Компьютерная томография сирийских хомяков проводилась аналогично человеческой. Данное исследование проводилось во всех исследуемых группах. Перед анализом хомяков усыпляли инъекцией кетамина (в дозе 100мг/кг массы тела).

2. Результаты

2.1 Содержание вируса в смывах слизистых оболочек носа и ротовой полости хомяков.

Заражение хомяков вирусом (штамм дельта) производилось в дозе 10⁶ ТЦД50/мл при внутриназальном и пероральном ингаляционном инфицировании. Положительные пробы из слизистых оболочек носа и ротовой полости изучались на наличие вируса. Через 48 часов после инфицирования у всех хомяков развивалась продуктивная инфекция вируса. Через 120 часов после инфицирования в группе контроля вируса его содержание снизилось, однако у всех хомяков выявлялись положительные пробы. Препарат «Арамакс виктори Антивирал» снижал содержание вируса в пробах, однако большинство проб было положительными на содержание вируса. (Рис 1).

2.2 Клинические особенности протекания коронавирусной инфекции у хомяков

В течение первой недели после заражения SARS-CoV-2 вес животных в контрольной инфицированной группе (без терапии «Арамакс виктори Антивирал») уменьшился на 10-14%. Однако в группах животных, получавших «Арамакс виктори Антивирал» потери массы тела не выявлено (рис 2). Через 48-72 часа после заражения SARS-CoV-2 у 50% животных отмечался подъем температуры тела. У сирийских хомяков, получавших «Арамакс виктори Антивирал» подобный эффект не наблюдался.

2.3 Анализ крови хомяков при коронавирусной инфекции

Изменение содержания лимфоидной популяции в группе здоровых хомяков, при коронавирусной инфекции, при терапии «Арамакс виктори Антивирал».

Как следует из рис 3., при коронавирусной инфекции в периферической крови хомяков происходит снижение содержания лимфоцитов, появление патологических лимфоцитов и ранних лимфоидных клеток (лимфобластов и/или пролимфоцитов). Препарат «Арамакс виктори Антивирал» восстанавливает лимфоидную популяцию в периферической крови практически до уровня здоровых животных. Однако «Арамакс виктори Антивирал» не предотвращает появление патологических лимфоцитов, характерных для коронавирусной инфекции.

Для миелоидной популяции в периферической крови хомяков при коронавирусной инфекции (рис 4) на начальной этапе заболевания характерно смещение влево (омоложение популяции с появлением ранних незрелых форм – метамиелоцитов и миелоидных клеток). Также появляются патологические нейтрофилы (гиперсегментированные, содержащие патологическую зернистость и др.) На более поздних стадиях заболевания происходит восстановление популяции. Препарат   «ARAMAX   VICTORY   Antiviral»    частично    восстанавливает   миелоидную популяцию в периферической крови хомяков при коронавирусной инфекции, а содержание

патологических нейтрофилов в крови соответствует позднему этапу коронавирусной инфекции.

Для моноцитарной популяции в периферической крови хомяков при коронавирусной инфекции (рис 5), на начальной этапе заболевания, характерно снижение содержания зрелых клеток и рост содержания монобластов. На поздних этапах заболевания происходит частичное восстановление популяции зрелых клеток и исчезновение монобластов. Препарат «Арамакс виктори Антивирал» почти полностью восстанавливает нормальную популяцию этих клеток.

2.3 Патология легких при экспериментальной коронавирусной инфекции

Анализ с помощью микро-КТ выявил серьезные аномалии легких у всех инфицированных животных, которых не было у контрольных животных (получивших физиологический раствор). Для сирийских хомяков характерно поражение легких, начиная с 32-48 часов после инокуляции вируса. Характерная картина выявляется при компьютерной томографии внутренних органов. В конце 2-х суток после заражения всем животным делали компьютерную томографию с целью контроля появления признаков пневмонии. У всех хомяков из всех групп в конце 2-х суток после заражения были зарегистрированы рентгенологические признаки вирусной пневмонии. КТ- аномалии легких были впервые обнаружены на 2-й день после инфицирования и начинались как нечеткое пятнистое помутнение в виде «матового стекла» Данное поражение описывается как типичная патология легких.

Оценка поражения легких проводилась послойно у каждого из исследованных хомяков отдельно (в виде % от объема пораженного легкого) и их суммированные данные представлены на рис 7. Как следует из рисунка 6, на 2й дпи у всех хомяков поражается около 35% объема легких (рис 6a,b,c) На 5й дпи объем пораженных легких снижается примерно до 25%, а полностью симптоматика исчезает значительно позже – после 10-15 дпи. Наши данные указывают на то, что

препарат практически полностью снимает патологический эффект вируса в легких хомяков (рис 6 d,e f).

3. Выводы

Препарат «Арамакс виктори Антивирал» обладает терапевтическим действием в отношении коронавируса человека SARS Cov-2 (штамм дельта), значительно смягчая патогенез вирусной инфекции у сирийских хомяков. Терапевтическое действие препарата проявляется в отсутствии повышения температуры и снижения веса, которые характерны при коронавирусной инфекции у сирийских хомяков. Также, при терапии изучаемым препаратом, наблюдается быстрая динамика снижения интерстициального воспаления легких хомяков. Препарат почти полностью снимает патологический эффект вируса в легких хомяков к концу 5х суток заболевания, в то время как в группе сирийских хомяков, зараженных SARS Cov-2 (штамм дельта) симптоматика поражения легких сохраняется до 2-4 недель.

Литература

Imai M, Iwatsuki-Horimoto K, Hatta M, Loeber S, Halfmann PJ, Nakajima N, Watanabe T, Ujie M, Takahashi K, Ito M, Yamada S, Fan S, Chiba S, Kuroda M, Guan L, Takada K, Armbrust T, Balogh A, Furusawa Y, Okuda M, Ueki H, Yasuhara A, Sakai-Tagawa Y, Lopes TJS, Kiso M, Yamayoshi S, Kinoshita N, Ohmagari N, Hattori SI, Takeda M, Mitsuya H, Krammer F, Suzuki T, Kawaoka Y. Syrian hamsters as a small animal model for SARS-CoV-2 infection and countermeasure development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Jul 14;117(28):16587-16595. doi: 10.1073/pnas.2009799117. Epub 2020 Jun 22. PMID: 32571934; PMCID: PMC7368255.

Зав. лаборатории клеточной биологии и вирусологии

Института молекулярной биологии НАН РА д.б.н. З. Каралян

Подпись З. Караляна заверяю

директор Института молекулярной биологии НАН РА к.б.н. А.Аракелян

Рис 1

Содержание вируса (SARS-CoV-2) в смывах слизистых оболочек носа и ротовой полости хомяков.

Рис 2

Изменение массы тела при инфекции SARS-CoV-2 и при терапии препаратом «Арамакс виктори Антивирал»

* Число инверсий u критерия равно 1 (p<0.05), по сравнению с группой получивших препарат.

Рис 3

Изменение лимфоидной популяции крови хомяков при инфекции SARS-CoV-2 и при терапии препаратом «Арамакс виктори Антивирал»

* Число инверсий u критерия равно 1 (p<0.05), по сравнению с положительным контролем

Рис 4.

Изменение миелоидной популяции крови хомяков при инфекции SARS-CoV-2 и при терапии препаратом «Арамакс виктори Антивирал»

* Число инверсий u критерия равно 1 (p<0.05), по сравнению с положительным контролем

Рис 5.

Изменение моноцитарной популяции крови хомяков при инфекции SARS-CoV-2 и при терапии препаратом «Арамакс виктори Антивирал»

* Число инверсий u критерия равно 1 (p<0.05), по сравнению с положительным контролем

Рис 6

Визуализация патологии легких при экспериментальной коронавирусной инфекции

Рис 7

Изменение объёма поражения легких при экспериментальной коронавирусной инфекции (анализ проведен субъективно двумя независимыми исследованиями)

* Число инверсий u критерия равно 0 (p<0.01), по сравнению с положительным контролем